Une nouvelle technique d’édition de gènes permet de réaliser simultanément des millions d’expériences génétiques –

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  • Les chercheurs ont créé un nouvel outil d’édition de gènes appelé Retron Library Recombineering (RLR) qui peut générer jusqu’à des millions de mutations simultanément, et des cellules bactériennes mutantes “ codes-barres ” afin que l’ensemble du pool puisse être criblé en même temps. Il peut être utilisé dans des contextes où CRISPR est toxique ou non réalisable, et se traduit par de meilleurs taux d’édition.

    Bien que le système d’édition de gènes CRISPR-Cas9 soit devenu le modèle de l’innovation en biologie synthétique, il présente des limites majeures. CRISPR-Cas9 peut être programmé pour trouver et couper des morceaux spécifiques d’ADN, mais l’édition de l’ADN pour créer les mutations souhaitées nécessite d’inciter la cellule à utiliser un nouveau morceau d’ADN pour réparer la rupture. Cet appât et interrupteur peut être compliqué à orchestrer, et peut même être toxique pour les cellules, car Cas9 coupe souvent également des sites non intentionnels et non ciblés.

    Des techniques alternatives d’édition de gènes appelées recombinaisons exécutent plutôt cet appât et interrupteur en introduisant un autre morceau d’ADN pendant qu’une cellule réplique son génome, créant efficacement des mutations génétiques sans briser l’ADN. Ces méthodes sont suffisamment simples pour pouvoir être utilisées dans de nombreuses cellules à la fois pour créer des pools complexes de mutations que les chercheurs pourront étudier. Déterminer quels sont les effets de ces mutations, cependant, nécessite que chaque mutant soit isolé, séquencé et caractérisé: une tâche longue et peu pratique.

    Des chercheurs du Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l’Université de Harvard et de la Harvard Medical School (HMS) ont créé un nouvel outil d’édition de gènes appelé Retron Library Recombineering (RLR) qui facilite cette tâche. RLR génère jusqu’à des millions de mutations simultanément, et des cellules mutantes «codes-barres» afin que l’ensemble du pool puisse être criblé en même temps, ce qui permet de générer et d’analyser facilement des quantités massives de données. La réalisation, qui a été accomplie dans les cellules bactériennes, est décrite dans un article récent dans PNAS.

    “RLR nous a permis de faire quelque chose d’impossible à faire avec CRISPR: nous avons découpé au hasard un génome bactérien, transformé ces fragments génétiques en ADN simple brin in situ et les avons utilisés pour cribler des millions de séquences simultanément”, a déclaré le co-premier auteur Max Schubert, Ph.D., post-doctorant dans le laboratoire de George Church, Ph.D., membre du corps professoral de Wyss Core. “RLR est un outil d’édition de gène plus simple et plus flexible qui peut être utilisé pour des expériences hautement multiplexées, ce qui élimine la toxicité souvent observée avec CRISPR et améliore la capacité des chercheurs à explorer les mutations au niveau du génome.”

    Retrons: de l’énigme à l’outil d’ingénierie

    Les rétrons sont des segments d’ADN bactérien qui subissent une transcription inverse pour produire des fragments d’ADN simple brin (ADNsb). L’existence de Retrons est connue depuis des décennies, mais la fonction de l’ADN ss qu’ils produisent a déconcerté les scientifiques des années 1980 à juin 2020, lorsqu’une équipe a finalement compris que l’ADN ss de Retron détecte si un virus a infecté la cellule, faisant partie de l’immunité bactérienne. système.

    Alors que les rétons étaient à l’origine considérés comme simplement une bizarrerie mystérieuse des bactéries, les chercheurs se sont davantage intéressés à eux au cours des dernières années car ils, comme CRISPR, pourraient être utilisés pour l’édition précise et flexible de gènes dans les bactéries, les levures et même les cellules humaines.

    «Pendant longtemps, CRISPR était simplement considéré comme une chose étrange que les bactéries faisaient, et trouver comment l’exploiter pour l’ingénierie du génome a changé le monde. Les rétrons sont une autre innovation bactérienne qui pourrait également fournir des avancées importantes», a déclaré Schubert. Son intérêt pour les rétons a été piqué il y a plusieurs années en raison de leur capacité à produire de l’ADN ss dans des bactéries – une caractéristique intéressante à utiliser dans un processus d’édition de gène appelé recombinaison d’oligonucléotides.

    Les techniques d’édition de gènes basées sur la recombinaison nécessitent l’intégration de l’ADNsb contenant une mutation souhaitée dans l’ADN d’un organisme, ce qui peut être fait de deux manières. L’ADN double brin peut être physiquement coupé (avec CRISPR-Cas9, par exemple) pour inciter la cellule à incorporer la séquence mutante dans son génome pendant le processus de réparation, ou le brin d’ADN mutant et une protéine d’hybridation simple brin (SSAP) peuvent être introduit dans une cellule qui se réplique afin que le SSAP incorpore le brin mutant dans l’ADN des cellules filles.

    «Nous avons pensé que les rétons devraient nous donner la capacité de produire de l’ADN ss dans les cellules que nous voulons modifier plutôt que d’essayer de les forcer dans la cellule de l’extérieur, et sans endommager l’ADN natif, qui étaient deux qualités très convaincantes», a déclaré co -le premier auteur Daniel Goodman, Ph.D., ancien boursier de recherche à l’Institut Wyss qui est maintenant boursier postdoctoral Jane Coffin Childs à l’UCSF.

    Un autre attrait des rétrons est que leurs séquences elles-mêmes peuvent servir de «codes-barres» qui identifient les individus dans un pool de bactéries qui ont reçu chaque séquence de rétron, permettant des criblages groupés considérablement plus rapides de souches mutantes créées avec précision.

    Pour voir s’ils pouvaient réellement utiliser des rétrons pour réaliser une recombinaison efficace avec des rétrons, Schubert et ses collègues ont d’abord créé des plasmides circulaires d’ADN bactérien contenant des gènes de résistance aux antibiotiques placés dans des séquences de rétron, ainsi qu’un gène SSAP pour permettre l’intégration de la séquence de rétron dans le génome bactérien. Ils ont inséré ces plasmides Retron dans des bactéries E. coli pour voir si les gènes ont été intégrés avec succès dans leurs génomes après 20 générations de réplication cellulaire. Initialement, moins de 0,1% d’E. Coli portant le système de recombinaison Retron incorporaient la mutation souhaitée.

    Pour améliorer cette performance initiale décevante, l’équipe a apporté plusieurs modifications génétiques à la bactérie. Premièrement, ils ont inactivé le mécanisme naturel de réparation des mésappariements des cellules, ce qui corrige les erreurs de réplication de l’ADN et pourrait donc «réparer» les mutations souhaitées avant qu’elles ne puissent être transmises à la génération suivante. Ils ont également inactivé deux gènes bactériens qui codent pour les exonucléases – des enzymes qui détruisent l’ADNsb flottant librement. Ces changements ont considérablement augmenté la proportion de bactéries qui ont incorporé la séquence de rétron, à plus de 90% de la population.

    Étiquettes de nom pour les mutants

    Maintenant qu’ils étaient convaincus que leur retron ssDNA était incorporé dans les génomes de leurs bactéries, l’équipe a testé s’ils pouvaient utiliser les retrons comme un «raccourci» de séquençage génétique, permettant de réaliser de nombreuses expériences dans un mélange. Parce que chaque plasmide avait sa propre séquence de rétron unique qui peut fonctionner comme une «étiquette de nom», ils ont estimé qu’ils devraient être capables de séquencer le rétron beaucoup plus court plutôt que le génome bactérien entier pour déterminer quelle mutation les cellules avaient reçue.

    Tout d’abord, l’équipe a testé si le RLR pouvait détecter des mutations connues de résistance aux antibiotiques chez E coli. Ils ont découvert qu’il pouvait – les séquences de rétronage contenant ces mutations étaient présentes dans des proportions beaucoup plus importantes dans leurs données de séquençage par rapport à d’autres mutations. L’équipe a également déterminé que le RLR était suffisamment sensible et précis pour mesurer de petites différences de résistance résultant de mutations très similaires. Fondamentalement, la collecte de ces données en séquençant les codes-barres de l’ensemble des bactéries plutôt qu’en isolant et en séquençant des mutants individuels accélère considérablement le processus.

    Ensuite, les chercheurs ont poussé le RLR un peu plus loin pour voir s’il pouvait être utilisé sur de l’ADN fragmenté au hasard, et découvrir combien de rétons ils pouvaient utiliser à la fois. Ils ont découpé le génome d’une souche d’E. Coli hautement résistante à un autre antibiotique et ont utilisé ces fragments pour construire une bibliothèque de dizaines de millions de séquences génétiques contenues dans des séquences de rétron dans des plasmides. “La simplicité de RLR a vraiment brillé dans cette expérience, car elle nous a permis de construire une bibliothèque beaucoup plus grande que ce que nous pouvons actuellement utiliser avec CRISPR, dans laquelle nous devons synthétiser à la fois un guide et une séquence d’ADN de donneur pour induire chaque mutation”, dit Schubert.

    Cette bibliothèque a ensuite été introduite dans la souche E coli optimisée RLR pour analyse. Une fois de plus, les chercheurs ont découvert que les rétons conférant une résistance aux antibiotiques pouvaient être facilement identifiés par le fait qu’ils étaient enrichis par rapport aux autres lors du séquençage du pool de bactéries.

    «La capacité d’analyser des bibliothèques de mutants à code-barres groupées avec RLR permet de réaliser des millions d’expériences simultanément, ce qui nous permet d’observer les effets des mutations à travers le génome, ainsi que la façon dont ces mutations pourraient interagir les unes avec les autres», a déclaré l’auteur principal George Church, qui dirige le domaine d’intervention de la biologie synthétique de l’Institut Wyss et est également professeur de génétique à HMS. “Ce travail aide à établir une feuille de route vers l’utilisation du RLR dans d’autres systèmes génétiques, ce qui ouvre de nombreuses possibilités intéressantes pour la recherche génétique future.”

    Une autre caractéristique qui distingue RLR de CRISPR est que la proportion de bactéries qui intègrent avec succès une mutation souhaitée dans leur génome augmente avec le temps à mesure que les bactéries se répliquent, alors que la méthode “one shot” de CRISPR a tendance à réussir ou à échouer du premier coup. RLR pourrait potentiellement être combiné avec CRISPR pour améliorer ses performances d’édition, ou pourrait être utilisé comme alternative dans les nombreux systèmes dans lesquels CRISPR est toxique.

    Il reste encore du travail à faire sur RLR pour améliorer et normaliser le taux d’édition, mais l’enthousiasme grandit pour ce nouvel outil. La nature simple et rationalisée de RLR pourrait permettre d’étudier la manière dont plusieurs mutations interagissent les unes avec les autres et de générer un grand nombre de points de données qui pourraient permettre l’utilisation de l’apprentissage automatique pour prédire d’autres effets de mutation.

    «Ce nouvel outil de biologie synthétique amène l’ingénierie du génome à des niveaux de débit encore plus élevés, ce qui conduira sans aucun doute à de nouvelles innovations passionnantes et inattendues», a déclaré Don Ingber, MD, Ph.D., directeur fondateur du Wyss Institute. Ingber est également professeur Judah Folkman de biologie vasculaire au HMS et au Boston Children’s Hospital, et professeur de bio-ingénierie à la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

    Les autres auteurs de l’article comprennent Timothy Wannier du HMS, Divjot Kaur de l’Université de Warwick, Fahim Farzadfard et Timothy Lu du Massachusetts Institute of Technology, et Seth Shipman du Gladstone Institute of Data Science and Biotechnology.

    Cette recherche a été financée par le Département de l’énergie des États-Unis (DE-FG02-02ER63445) et par le National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship.

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